在荷蘭格羅寧根大學(xué)的Martien Kas實驗室工作的貝蒂·霍尼克斯（Betty Hornix），通過這篇文章向大家非常詳細地描述了如何使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）進行視頻跟蹤設(shè)置并執(zhí)行小鼠嗅覺測試。

嗅覺和行為

人與動物之間的相互作用取決于適當?shù)男嵊X處理，當這個過程出現(xiàn)問題時，可能會影響正常的社交行為（Hornix等人，2018）。

正確分析嗅覺對于準確解釋小鼠各種行為至關(guān)重要，尤其是觀察社交行為。下面我們將描述如何進行嗅覺習慣/去嗅覺習慣測試。我們將解釋如何DIY自己的測試籠，哪些準備工作是必要的，如何執(zhí)行測試，以及如何使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）分析視頻。

嗅覺習慣測試

嗅覺習慣/去嗅覺習慣測試（OHDT）評估動物是否能夠檢測和區(qū)分不同的氣味。它由不同氣味的連續(xù)呈現(xiàn)組成。我們使用了一系列的水、兩種非社會性氣味和兩種社會性氣味。

每種氣味在持續(xù)2分鐘的三次連續(xù)試驗中呈現(xiàn)給動物（見以下時間表）。在這三次試驗中，氣味的嗅覺調(diào)查減少被定義為習慣化。當出現(xiàn)一種新的氣味時，動物發(fā)現(xiàn)嗅覺增加時，會表現(xiàn)出一種被稱為去嗅覺習慣的整體行為。

最少的試驗操作

這里描述的方法，即嗅覺習慣/去嗅覺習慣測試，因為籠子內(nèi)部不受干擾，所以涉及較少試驗操作（Yang&Crawley，2009和Oumadi等人，2019）。由于氣味刺激物（500 ul試管內(nèi)的用棉花密封）不會接觸籠子或籠子蓋的任何部分，因此避免了交叉試驗污染。

如何制作自己的測試籠

該測試可以在需要進行一些小調(diào)整的普通家庭籠中執(zhí)行。每天測試的每只動物都使用一個單獨的籠子，可以避免氣味留在籠子里。

我們在籠子的短邊燒了一個洞，用一個釘子在小錫罐上打了個洞。小錫罐用熱膠粘在每個籠子燒過的洞里（見下圖）。我們建議不要使用硅膠膠，因為氣味很重，希望盡量減少分散注意力的氣味。

氣味將通過這個錫罐呈現(xiàn)給動物。這樣，在測試過程中，保持籠子內(nèi)部不會受到干擾。

測試前的必要準備

測試連續(xù)兩天進行。第一天，動物適應(yīng)了籠子，并準備好了氣味管。此外，清潔籠子，并填充了小墊層。我們使用了一種非常溫和的清潔劑來減少籠子里的氣味。

適應(yīng)和測試

動物適應(yīng)試驗籠

我們使用了500 ul的試管，通過錫罐向動物呈現(xiàn)氣味。每只動物需要準備17根管子，管子的一端切掉（見下圖）。其中兩個試管中充滿了干棉簽。在準備測試和執(zhí)行的每一步中都必須戴手套，盡可能防止氣味轉(zhuǎn)移。

下午，每只動物都要適應(yīng)測試籠30分鐘，同時將一根帶有干棉簽的管子插入錫罐中。

嗅覺刺激的準備

測試當天上午，氣味管準備就緒。我們使用了水、杏仁提取物、橙子提取物、幼年糞便、成年糞便。之所以選擇杏仁和橙子提取物，是因為它們氣味非常特別，但氣味中性。

我們按照測試的順序（蒸餾水>杏仁（1:15）>橙子（1:5）>社會氣味1>社會氣味2）在水中和試管中準備稀釋液，在不同氣味之間記得更換手套，不要觸摸棉簽的棉端（見上圖）。不要混合氣味是非常重要的！這是一項非常耗時的任務(wù)，所以要花足夠的時間來準備一切。

執(zhí)行測試

該測試總共需要49分鐘，包括在開始時用一根新管握住一根干棉簽進行5分鐘的馴化。氣味一次出現(xiàn)3次，每次持續(xù)2分鐘，ITI為1分鐘，總共15次試驗（見上述時間表）。我們使用多視頻錄制軟件（Media Recorder）從測試臺上方錄制視頻。

動物可以自由探索試驗籠。在準備氣味時以及在動物變化之間需要非常小心（通過不斷更換手套），以避免轉(zhuǎn)移和混合氣味。

多只動物可以在它們自己的測試籠中同時進行測試，只要注意準確呈現(xiàn)氣味的時間，以便使用EthoVision XT 16成功進行自動分析。

使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）分析視頻

在動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）中，當動物的鼻尖位于我們在3.5厘米錫罐周圍數(shù)字標記的區(qū)域內(nèi)時，我們測量了嗅氣味所花費的時間。

數(shù)據(jù)的提取和可視化

數(shù)據(jù)以1分鐘的時間段導(dǎo)出，并將每次試驗的2分鐘持續(xù)時間相加。我們通過繪制15次試驗中嗅氣味的時間來可視化結(jié)果。在這項實驗中，習慣和去習慣對非社會性氣味和第一種社會性氣味都非常有效。這是顯而易見的，因為在3次試驗中，每種氣味的嗅聞時間都有所減少。

此外，當氣味變?yōu)樾職馕稌r，嗅聞時間會增加。此外，這些動物能夠以類似的方式區(qū)分第一種社交氣味和最后一種非社交氣味。他們更難區(qū)分這兩種社交氣味。我們建議使用特別的社交氣味，例如不同品種或更大年齡差異的氣味。

嗅覺的有效測試和自動化

總之，嗅覺習慣/去嗅覺習慣測試對于測試嗅覺功能和分離嗅覺行為中的不同特征非常有效。此外，這種方法使動物在測試過程中不受干擾，減少了動物壓力，使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT）自動化分析成為可能。

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